本教材主要包括以下内容：抗体制备技术、抗原抗体反应、免疫标记技术、免疫细胞检测技术、细胞因子及其受体的检测、 HLA分型技术、免疫 PCR技术、超敏反应的检测、免疫学常用实验动物技术、免疫学实验常用仪器、常用试剂的配制、常用免疫学检验正常值、试剂的浓度。
本教材可作为高等医药院校本科生及研究生医学免疫学课程的实验教材，也可供医学同行参考。
本教材共包括八章实验和附录内容。在教材的编写体例上，按照实验目的、原理、材料、实验步骤、实验结果、注意事项、临床意义、思考题几个方面的顺序编排，使学习者一目了然；实验项目基本上是教师多年教学和科研实践证明的切实可行的实验，并且增加了一些有利于学生综合素质和创新能力培养的综合实验，以及与临床疾病检测相关的实验内容，同时也关注实验操作中的关键环节和实验的基本技能的介绍。本教材概念准确、条理清楚、简明扼要，具有科学性、先进性、实用性和可操作性。本教材适用于高等医学院校本科生及研究生医学免疫学实验教学，以及相关医学研究的科技和医务工作者参考。
第 1章 抗体制备技术 1
实验一 多克隆抗体的制备 .1
一、抗体制备的流程 .1
二、兔抗人全血清的多克隆抗体制备 .3
三、兔抗羊红细胞的多克隆抗体制备 .5
实验二 单克隆抗体的制备 .6
实验三 抗体的纯化与保存 .11
一、特异性抗体的纯化 .11
二、 IgG的纯化 .11
三、 IgM的纯化 .15
四、 SDS-PAGE法检测免疫球蛋白纯度 .16
五、抗体的保存 .17
第 2章 抗原抗体反应 18
实验四 凝集反应 .18
一、 ABO血型的鉴定（玻片法） .18
二、 SPA协同凝集试验——颗粒性抗原的检测 .20
三、间接凝集抑制试验——妊娠检验 .22
四、间接血凝试验 .22
五、反向间接血凝试验 .24
实验五 免疫沉淀反应 .25
一、双向免疫扩散 .25
二、单向免疫扩散 .26
三、环状沉淀试验——血迹鉴定 28
四、琼脂凝胶对流免疫电泳 29
五、火箭免疫电泳试验 .30
六、免疫浊度测定 .32
实验六 补体结合试验 .33
实验七 免疫印迹技术 .35
VI 医学免疫学实验
第 3章 免疫标记技术 39
实验八 酶免疫技术 39
一、酶联免疫吸附试验 .39
二、酶免疫组织化学技术 42
实验九 荧光免疫技术 .43
一、直接免疫荧光法——检测 B细胞膜表面免疫球蛋白 .43
二、间接免疫荧光法——检测痢疾杆菌 .44
实验十 生物素 -亲和素技术 .46
第 4章 免疫细胞检测技术 48
实验十一 人外周血单个核细胞分离及观察 .48
实验十二 T细胞功能检测 49
一、 T淋巴细胞转化试验 49
二、 E花环形成试验 51
三、流式细胞术检测法 .52
四、 CTL介导的细胞毒试验 .53
实验十三 B细胞功能检测——溶血空斑试验 55
实验十四 固有免疫细胞功能检测 .56
一、炎症模型建立及细胞吞噬现象观察 .56
二、 NK细胞介导的细胞毒试验 .58
第 5章 细胞因子及其受体的检测 60
实验十五 白细胞介素 -1的检测 60
实验十六 白细胞介素 -2的检测 62
实验十七 白细胞介素 -2受体的检测 63
一、可溶性白细胞介素 -2受体的检测 .64
二、膜结合型白细胞介素 -2受体阳性细胞检测 65
实验十八 肿瘤坏死因子的检测 .66
一、肿瘤坏死因子的含量检测 66
二、肿瘤坏死因子的活性检测 67
第 6章 HLA分型技术 . 69
实验十九 补体介导的细胞毒试验 .70
实验二十 混合淋巴细胞培养 .71
实验二十一 PCR-SSP检测 HLA-B27 .72
实验二十二 HLA基因分型——限制性片段长度多态性法 73
第 7章 免疫 PCR技术 76
实验二十三 免疫 PCR法检测人肿瘤坏死因子 76
第 8章 超敏反应的检测 79
实验二十四 豚鼠过敏试验 .79
实验二十五 青霉素过敏试验 .80
实验二十六 血清 IgE测定 .81
一、血清总 IgE测定 .82
二、特异性 IgE测定 .83
实验二十七 自身抗体检测 .83
一、抗核抗体检测 .84
二、抗胰岛素抗体检测 .85
实验二十八 循环免疫复合物检测 .86
一、 PEG沉淀法检测循环免疫复合物 86
二、含甲状腺球蛋白免疫复合物的测定 .87
实验二十九 类风湿因子的检测 .88
一、胶乳凝集试验测定类风湿因子 88
二、 ELISA法测定类风湿因子 89
实验三十 结核菌素试验 .90
实验三十一 植物血凝素皮肤试验 .91
附录 93
附录Ⅰ 试剂的浓度 .93
附录Ⅱ 常用免疫学检验正常值 .94
附录Ⅲ 常用实验动物技术 .96
附录Ⅳ 免疫学实验常用仪器 .99
附录Ⅴ 免疫学常用试剂的配制 .103
附录Ⅵ 实验室规则 .106
附录Ⅶ 医学免疫学实验报告册 .107
参考文献 …122
抗体（ antibody，Ab）是机体 B淋巴细胞受到抗原刺激后所产生的特异性球蛋白，故亦称为免疫球蛋白。机体初次接触抗原后，激发机体产生的特异性抗体亲和力低、持续时间短；而当同一抗原再次刺激机体后，则能产生高亲和力、高效价、持续时间长的抗体。由于抗体能与相应的抗原发生特异性结合反应，因此特异性抗体是免疫学实验中常用的试剂，不仅对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，而且广泛应用于临床疾病的诊断、治疗和预防中。在免疫学检测中应用的主要抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则采用杂交瘤技术制备。本章主要介绍这两种抗体的制备方法。实验一 多克隆抗体的制备多克隆抗体（ polyclonal antibody）是机体针对抗原的不同表位所产生的抗体混合物。是用制备的纯化免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，在含有多种抗原表位的抗原刺激下，该动物体内多个 B细胞克隆被激活并产生针对这种抗原多种不同表位的抗体混合物。含有这些特异性抗体的动物血清称为免疫血清或抗血清，而从免疫血清中纯化的免疫球蛋白则称为抗体。一、抗体制备的流程优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，动物的应答能力以及免疫程序（如免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素）。因此制备高质量的抗体必须具备理想的免疫原、适宜的动物和切实可行的免疫方案。（一）免疫动物的选择免疫用的动物主要为哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、豚鼠及小鼠等。选择动物要依据抗体制备的条件而定。 1．抗原与动物的种系 抗原的来源与免疫动物之间种系关系越远，其抗原免疫原性越强，越易产生免疫应答；反之，种系关系越近，则抗原免疫原性越弱。如用鸡球蛋白免疫亲缘关系较近的鸭或鹅，则免疫原性较差。
2．动物的个体状况 动物的年龄与健康状况可影响产生抗体的效价，年龄太小者易产生免疫耐受，而年老体衰者免疫应答能力低下，不易产生高效价的抗体。所以用于制备抗血清的动物必须是适龄、健壮、体重合乎一定要求的健康动物。免疫过程中应特别注意营养和卫生管理。
3．抗体的用量和要求 动物的选择常根据抗体的用途和量来决定。制备量大的抗体常选择羊、马等大动物；如所需抗体的量少，宜用小动物，如家兔、豚鼠等。对蛋白质抗原大部分动物均适合，常用家兔和山羊。制备供补体试验用的抗体可选择豚鼠。
（二）免疫方案不同的抗原，其免疫原性的强弱不一，这取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。在免疫动物时应考虑免疫原的剂量、免疫途径、次数和免疫间隔时间等因素对免疫效果的影响。
1．免疫原的剂量 抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、注射途径、免疫次数以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。免疫原剂量过大或过小都易引起免疫耐受。在中间剂量范围内，免疫原剂量适当加大，时间间隔延长，可产生较高效价的抗体。一般而言，小鼠首次免疫剂量为每次 50～400μg，大鼠为每次 100μg～1mg，兔为每次 200μg～1mg。加强免疫剂量为首次剂量的 1/5～2/5。如要制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；如欲获得高效价的抗血清，则宜采用大剂量抗原长程免疫法。
2．免疫途径、次数和间隔时间 常根据抗原性质、免疫原性及动物的免疫反应性决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。抗原注射途径可根据不同抗原及实验要求，选用皮内、皮下、肌肉、腹腔、静脉或淋巴结等不同途径进行免疫。一般多采用动物的背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。两次免疫注射的间隔时间应长短适宜，太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般第一次和第二次间隔 10～20d，3次及以后间隔 7～10d，加佐剂者应为 2周左右。免疫的总次数一般为 5～8次。
3．佐剂的应用 佐剂可增强抗原的免疫原性，使无或弱免疫原性的物质变成有效免疫原。如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔，在加用佐剂时一次注入剂量一般为 0.5mg/kg，如不加佐剂，则抗原剂量应加大 10～20倍。动物实验中最常使用的佐剂为弗氏不完全佐剂（ Freund incomplete adjuvant，FIA）和弗氏完全佐剂（ Freund complete adjuvant，FCA），前者是将抗原和油剂（液状
1石蜡或花生油）混合，再加入乳化剂（羊毛脂或吐温 .80①），使之成为油包水乳剂。在弗氏不完全佐剂中加入死的分枝杆菌即为弗氏完全佐剂。初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，则采用弗氏不完全佐剂。对可溶性抗原常需加用佐剂，以增强抗原的免疫原性，刺激机体产生较强的免疫应答。（三）免疫血清效价的鉴定测定免疫血清效价是及时掌握对免疫动物采血时机的重要步骤，又称试血。 1．颗粒性抗原相应抗体效价的测定 如细菌性抗原多用凝集反应测定，细胞性抗原可用补体依赖的细胞毒实验等方法测定相应的抗体。
2．可溶性抗原相应抗体效价的测定 多采用沉淀反应及简便快速的方法如酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），更为灵敏的放射免疫测定法进行测定。
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