抗体制备及使用实验指南

定　　价：78 元

丛书名：生命科学实验指南系列

• 作者：(美)霍华德(Howard,G.C.)，(美)凯瑟(Kaser,M.R.)著
• 出版时间：2010/8/1
• ISBN：9787030285560
• 出 版 社：科学出版社

适用读者:从事生物学、免疫学、生物化学与分子生物学、医药卫生科学领域的科研技术人员，以及高等院校师生

• 中图法分类：Q939.91-33 
• 页码：293
• 纸张：胶版纸
• 版次：1
• 开本：16开
• 字数：(单位：千字)

内容简介

    《抗体制备与使用实验指南》收集了抗体制备与使用中的基本实验方法及相关的最新科研进展，这些方法是开展抗体制备研究的必备知识，包括鼠源性单克隆抗体的制备、纯化、应用以及抗体的修饰等，同时也包括部分基因重组性单克隆抗体，涉及内容具体、全面，反映了国际上的最新发展方向。
    《抗体制备与使用实验指南》对从事生物学、免疫学、生物化学与分子生物学、医药卫生科学领域的科研技术人员，以及高等院校师生具有参考价值。

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序 言

    抗体可称为在地球上生命的发展历史中最重要的一群蛋白。这些“魔弹”已经成为生物学和医学研究中不可或缺的工具。在近25年生物学领域所收获的重要知识的浪潮中，抗体起着关键性的作用，而在医学实践方面，各种各样疫苗的研究成功和使用已经使多种传染性疾病得到了控制（至少在发达国家是这样），例如脊髓灰质炎、腮腺炎、麻疹、水痘等，并且已基本使天花绝迹。
    我们希望本书对生物医学领域的研究人员和学生有所帮助。尽管未来在制备和使用抗体方面一定还会出现新的方法，但目前抗体的使用方法，如酶联免疫试验（ELISAs）、蛋白质印迹方法（Western Blot）、免疫组化、流式细胞术等，其功能是如此强大，以致于在未来相当长的时间内这些技术方法仍将对生物医学科学领域起着关键作用。
    我们想在此对本书的所有作者表达深切谢意，在他们杰出的专业知识，优秀的写作和对本书的热心支持下，本书的出版才成为可能。我们也想在此深切感谢CRC出版公司负责本书出版工作的编辑Judith Spiegel，感谢她对本书的诸多帮助和极大的耐心。

目 录

目录
译者序
前言
第1章 抗体 1
1.1 一种多功能分子——抗体 1
1.2 相关伦理思考 3
1.3 实验室安全 4
1.4 手册编排 4
参考文献 4
第2章 抗原 5
2.1 抗原的选择 6
2.2 多肽抗原 6
2.2.1 多肽抗原的免疫进度表 7
2.3 蛋白质抗原 7
2.3.1 原核蛋白 8
2.3.2 真核蛋白 11
2.4 全细胞免疫原 12
2.4.1 全细胞免疫原的免疫方案 13
2.5 基因免疫 14
2.5.1 质粒DNA 14
2.5.2 腺病毒 16
参考文献 17
第3章 佐剂 20
3.1 引言 20
3.2 佐剂的使用 22
3.2.1 总体要求 22
3.2.2 弗氏佐剂的使用 23
3.2.3 TiterMax佐剂的使用方案 25
3.2.4 Ribi佐剂系统(RAS)的应用 26
3.2.5 CJerbu佐剂的应用 27
3.2.6 Imjcct铝盐佐剂的使用 27
参考文献 28
第4章 多克隆抗体制备 30
4.1 概要 30
4.2 抗原提呈细胞 30
4.2.1 B细胞的抗原识别 32
4.2.2 T细胞的抗原识别 32
4.2.3 B细胞受体和抗体产牛 34
4.2.4 免疫记忆 34
4.2.5 抗体 34
4.2.6 佐剂的作用 35
4.2.7 抗原特点 39
4.2.8 免疫途径 40
4.2.9 免疫步骤 44
4.2.10 物种选择 44
4.3 结论 48
参考文献 48
第5章 单克隆抗体的制备 55
5.1 引言 55
5.2 材料 56
5.2.1 免疫原 56
5.2.2 免疫用的动物 57
5.2.3 免疫策略 58
5.3 免疫程序 60
5.3.1 培养基和骨髓瘤细胞 60
5.3.2 免疫B细胞的制备 63
5.3.3 融合和铺板 63
5.3.4 筛选 65
5.3.5 业克隆和低温冻存 66
5.3.6 杂交瘤细胞的扩增 68
5.4 结论 69
参考文献 70
第6章 单克隆抗体的定量生产 72
6.1 引言：方法比较 72
6.2 抗体制备方法概况 72
6.2.1 产量 73
6.2.2 费用和设备 73
6.2.3 动物福利 73
6.2.4 免疫活性分子污染 74
6.2.5 微生物污染 74
6.2.6 抗体糖基化 75
6.3 腹水的制备 75
6.3.1 方法概述 75
6.3.2 免疫原同种异体反应性或异种抗原反应性的对策 76
6.3.3 体内制备方案：BALB／c小鼠腹水 77
6.3.4 体内单克隆抗体的制备：通过异种的杂交瘤细胞系制备腹水 80
6.4 细胞培养制备单克隆抗体 83
6.4.1 在研究实验室中体外制备单克隆抗体 83
6.4.2 实验方案：在CELLine CL-1000培养瓶中制备单克隆抗体 85
6.4.3 用重组和转基冈系统制备抗体 89
6.5 结论 89
参考文献 89
第7章 抗体的纯化和鉴定 94
7.1 引言 94
7.2 抗体纯化 94
7.2.1 通过沉淀进行部分纯化 95
7.2.2 蛋白质A和蛋白质G 97
7.2.3 IgM和FAB抗体片段的纯化 103
7.3 抗体的鉴定 107
7.3.1 区带（醋酸纤维）电泳 107
7.3.2 通过280nm吸光度测定抗体浓度 108
7.3.3 SDS—PAGE 109
7.3.4 免疫印迹 111
7.3.5 等电聚焦 113
7.3.6 酶免疫分析 114
7.4 结语 116
参考文献 116
第8章 细菌中制备抗体 117
8.1 引言 117
8.2 所需材料 119
8.3 方法 121
8.3.1 噬粒设计 121
8.3.2 文库构建 122
8.3.3 抗原特异性抗体的筛选 128
参考文献 132
第9章 抗体的化学和蛋白水解修饰 136
9.1 引言 136
9.2 J般步骤 137
9.2.1 抗体溶液的稳定性 137
9.2.2 抗体的定量 138
9.2.3 抗体的浓缩和缓冲液置换 140
9.3 胺类的修饰 142
9.3.1 总体考虑 142
9.3.2 胺反应试剂的分类 144
9.3.3 NHS-PE04-BIOTIN的生物素化反应 146
9.3.4 用荧光染料进行标记 151
9.3.5 巯基的导入 152
9.3.6 聚乙二醇化 154
9.3.7 与螯合剂的偶合 154
9.4 巯基和二硫键的修饰 156
9.4.1 IgG的二硫键和巯基 156
9.4.2 二硫化物的互换反应 157
9.4.3 其他涉及巯基和二硫键的氧化还原试剂 161
9.4.4 用卤代烃和N-烷基马来酰亚胺进行硫醇的烷基化 162
9.5 碳水化合物修饰 163
9.5.1 范例流程10：用)Jal04氧化IgG的碳水化合物部分 164
9.5.2 范例流程11：DAVI)B酰肼与氧化型IgG的偶合 165
9.6 抗体的同相化 165
9.6.1 聚苯乙烯培养皿和ELISA孔的固相化 165
9.6.2 与亲和介质的共价偶合 166
9.6.3 经生物素介导与亲和介质的固相化 168
9.7 蛋白的水解修饰 170
9.7.1 木瓜蛋白酶水解兔IgG制备Fab片段 172
9.8 抗体与其他蛋白质的交联 177
9.8.1 范例流程18：肼与IgG氨基的交联 178
9.8.2 范例流程19：醛与另一个蛋白质氨基的交联 180
9.8.3 范例流程20：MEHN-IgG与FB-蛋白质的交联 181
参考文献 182
第10章 抗体的应用 184
10.1 引言 184
10.2 蛋白质转印 185
10.2.1 转印设备 185
10.2.2 转印缓冲液 187
10.2.3 条件的优化 187
10.2.4 转印膜 187
10.3 检测 189
10.3.1 蛋白质印迹的直接染色 189
10.3.2 抗原的检测 189
10.3.3 蛋白质免疫印迹的检测抗体 190
10.3.4 免疫印迹实验中抗体的替代品 191
10.3.5 蛋白质免疫印迹的定量 192
10.3.6 相对分子质量标准品 193
10.4 蛋白质免疫印迹实验的操作程序 194
10.4.1 操作流程 195
10.4.2 免疫印迹实验需要的溶液 196
10.5 实验假象以及故障的诊断和排除 198
10.6 抗体芯片 198
10.7 临床应用 199
10.8 免疫沉淀反应及其相关应用 200
10.9 总结 201
参考文献 202
第11章 免疫组织化学法 206
11.1 引言 206
11.1.1 方法学概述 206
11.1.2 对新的免疫组织化学方法进行标准化的一种实用方法 206
11.1.3 免疫组织化学巾的抗体 207
11.2 组织准备 208
11.2.1 载玻片 209
11.2.2 细胞涂片／离心细胞涂片制备 209
11.2.3 冰冻切片 210
11.2.4 石蜡切片 210
11.2.5 细胞块 211
11.3 酶标记 211
11.3.1 辣根过氧化物酶 212
11.3.2 碱性磷酸酶 212
11.4 背景与非特异反应产生的原因 212
11.4.1 内源性酶活性 212
11.4.2 其他内源性物质活性 213
11.4.3 一扰产牛的非特异结合反应或背景染色的原因 213
11.4.4 疏水作用和离子相互作用产生的背景 214
11.5 抗原修复技术(AR) 215
11.5.1 去污剂和离液序列高的物质 215
11.5.2 酶抗原修复法 216
11.5.3 热诱导抗原决定簇修复(HIER) 216
11.6 免疫酶技术 218
11.6.1 直接法 219
11.6.2 问接法 220
11.6.3 多步法 221
11.7 免疫荧光技术 227
11.7.1 荧光染料 227
11.7.2 间接免疫荧光技术 228
附录 228
A.1 免疫组织化学染色试剂 228
A.1.1 内源性过氧化物酶封闭液 228
A.1.2 内源性碱性磷酸酶封闭液 229
A.1.3 非特异结合性封闭液 230
A.1.4 内源性亲和素／生物素封闭液 230
A.1.5 抗原修复缓冲液 231
A.1.6 胰蛋白酶抗原修复溶液 231
A.1.7 抗原修复中的蛋白酶 232
A.1.8 抗原修复中的胃蛋白酶 232
A.1.9 漂洗缓冲液TBS 500mmol/L，pH7.6 232
A.1.10 磷酸盐缓冲液(PBS)，20mmol/L，pH7.0 233
A.1.11 抗体稀释缓冲液 233
A.1.12 底物及色原的制备 234
参考文献 238
第12章 免疫电子显微镜 239
12.1 引言 239
12.2 抗体 240
12.2.1 一抗 240
12.2.2 常见问题解析 240
12.2.3 二抗 241
12.2.4 试剂滴定 211
12.2.5 非特异性背景染色 212
12.2.6 对照 243
12.3 标记物 243
12.3.1 胶体金 243
12.3.2 其他电子密度标记物 215
12.3.3 晕金属标记物显色的故障诊断与排除 215
12.3.4 多熏标记应用 245
12.3.5 标记定量 246
12.4 组织标记 246
12.4.1 同定 216
12.4.2 包埋前标记 216
12.4.3 颗粒样本 247
12.4.4 复型标记 248
12.4.5 冷冻切片标记 248
12.4.6 非冷冻组织包埋后标记 250
12.6.7 冷冻置换 251
12.5 与其他免疫显微镜的相关性 251
参考文献 252
第13章 流式细胞术 256
13.1 引言 256
13.1.1 现有技术 256
13.1.2 抗体选择 257
13.1.3 实验初始应考虑的因素 257
13.1.4 对照 258
13.1.5 特异性 258
13.1.6 仪器显示和质量控制 259
13.2 免疫分型 260
13.2.1 抗体滴度测定 260
13.2.2 直接标记法 264
13.2.3 间接标记法 266
13.2.4 胞内标记法 268
参考文献 271
第14章 酶联免疫吸附试验 272
14.1 引言 272
14.2 准备 272
14.2.1 抗体 272
14.2.2 检测反应 274
14.3 安全性 275
14.3.1 “夹心”ELISA 275
14.3.2 “竞争”ELISA 276
参考文献 278
第15章 抗体的未来：挑战与机遇 280
15.1 引言 280
15.2 抗体的新来源 280
15.2.1 从转基因动物制备人类抗体 280
10.2.2 基因免疫制备抗体 280
15.2.3 avimer：替代抗体 281
15.3 便用抗体的新方法 281
15.3.1 抗体片段和单功能区抗体 281
10.3.2 抗体和蛋白组学 282
15.3.3 杂合和嵌合抗体的表达载体 282
10.3.4 DNA疫苗 282
15.3.5 抗体的其他应用 282
15.4 未来 283
参考文献 283
索引 285

文 摘

    2.2多肽抗原
    多肽无疑是生产抗原的最快方式，可用于免疫接种来制备抗体。许多机构和公司发现保持核心多肽合成的能力经济有效。如果不具备多肽合成能力，一些商业公司提供多肽合成定制服务。这种方法可靠、经济，可在几周之内提供高质量的多肽，其数量足以用于免疫接种。对于典型的多肽免疫原，大约500美元可以买到10mg含15个氨基酸并且纯度>80％的多肽（circa 2005），这些多肽足够免疫几个动物来得到抗体，并用酶联免疫吸附试验进行抗体筛选。
    多肽可以特别有效地提高抗体对抗原某区域的特异性，如新的结构域或同源性最低的区域。当抗原没有其他来源的时候，也可使用多肽。许多情况下，重组蛋白因为不能被表达和纯化而不能作为抗原的来源。对于大分子跨膜蛋白，如G蛋白偶联受体（在制药领域重要的分子家族）来说这是经常发生的，对应胞外结构域蛋白环状结构的短肽已被证明是可行的免疫原，可以产生针对这些复杂分子的抗体。
    由6个氨基酸组成的肽可以用来制备抗血清，由10～12个氨基酸残基组成的多肽通常有更高的免疫原性[2]。一个较短的抗原表位的例子是Flag标签，其在蛋白质纯化、鉴定和功能分析领域被广泛使用。这是一个八肽序列（DYKDDDDK），其单克隆抗体和多克隆抗体很容易买到。我们发现由12～15个氨基酸组成的多肽在多数情况下都是非常好的免疫原。由30～35个氨基酸组成的较长多肽，虽然本身化学合成受限，但也是非常好的免疫原，其优点是可能会形成相关的二级结构。多肽免疫原使用受限是因为其线性表位序列短，在一个完整的蛋白质抗原中不易被识别。因而由多肽产生的抗体趋向于识别线性表位，总的来说，在免疫印迹实验和其他识别变性蛋白的抗体实验中效果非常好。然而，由多肽产生的抗体通常不能识别蛋白质构象，因此不太可能和天然分子反应。这样的抗体往往没有功能，不能用于流式细胞仪。但是应该指出的是，在有些情况下多肽免疫原确实能够生成能识别天然蛋白质的抗体。例如，当蛋白质抗原的线性表位没有被其三级结构所掩盖的时候。